Intranet Areál web

Fyziologický ústav AV ČR

Špičková věda pro zdraví

Studium regulačních proteinů účastnících se G-proteinové signalizace: RGS3 a fosducinu.


Regulátor G-proteinové signalizace (RGS3) se váže na Gα-GTP komplex a zvyšuje tak jeho vnitřní GTPasovou aktivitu - ukončuje přenos signálu. Fosducin (Pdc) je vysoce konzervovaný fosfoprotein, který hraje důležitou roli v regulaci G-proteinové signalizace, kontroly transkripce a regulaci krevního tlaku. Pdc i RGS3 jsou negativně regulovány fosforylací a vazbou proteinu 14-3-3. 

Biofyzikální studie

Naše data naznačují, že fosforylace na N-koncové doméně fosducinu (na serinu 54 a serinu 73) ovlivňují strukturu celé molekuly fosducinu. Komplex tvořený s proteinem 14-3-3 snižuje flexibilitu jak na v obou koncových částech fosforylovaného fosducinu (N- i C-konec), což jsme potvrdili časově-rozlišenou tryptofanovou a dansylovou fluorescencí. Naše data naznačují, že  fosforylovaný fosducin podstoupí konformační změnu po vazbě na protein 14-3-3. Tyto změny zahrnují vazebný povrch Gtbg v rámci N-koncové domény fosducinu a tak by mohly vysvětlit inhibiční efekt proteinu 14-3-3 na funkci fosducinu. 

 

Inhibiční vliv proteinu 14-3-3 na funkci RGS3
V roce 2010 jsme vyřešili krystalovou strukturu RGS domény v rozlišení 2.3 Å. Data obdržená z vyřešené struktury RGS domény naznačují, že konformační změny indukované proteinem 14-3-3 ovlivňují oblast v rámci Ga-interagující části RGS domény (Rezabkova et. al., 2010).
V roce 2011 jsme použili nízkoúhlový rozptyl světla, vodíko-deuteriovou výměnu a Försterův resonanční přenos energie k určení struktury komplexu protein 14-3-3ζ s RGS3 (Rezabkova et al., 2011).

 

 

 

Stužková reprezentace struktury komplexu RGS domény a proteinu 14-3-3 se vzdálenostmi určenými pomocí FRET měření (Rezabkova et. al., 2010)

Struktura komplexu 14-3-3:pRGS3 s nízkým rozlišením obdržená z měření SAXS (Rezabkova et al., 2011).

 
Inhibiční vliv proteinu 14-3-3 na funkci fosducinu (Pdc)
Abychom nahlédli do úlohy proteinu 14-3-3 v regulaci fosducinu, studovali jsme strukturní změny fosducinu indukované fosforylací a vazbou proteinu 14-3-3 použitím časově rozlišené fluorescenční spektroskopie.  (Rezabkova et al., 2012).    V roce 2015 jsme podali mechanistické vysvětlení pro inhibiční funkci fosducinu prostřednictvím proteinů 14-3-3, prokázali jsme, že fosducin je vnitřně neuspořádaný protein, který se vazbou 14-3-3 strukturuje. Rovněž jsme vyřešili strukturu Pdc s nízkým rozlišením  (Kacirova et. al., 2015).

Protein 14-3-3ζ interaguje a stéricky blokuje N- i C-koncovou část Gtβγ vazebného povrchu fosducinu (Kacirova et al. 2015)