Cirkadiánní hodiny a mechanismy jejich seřizování
Zkoumáme seřizování cirkadiánních hodin a jeho poruchy na řadě experimentálních modelů in vivo nebo in vitro.
Cirkadiánní hodiny běží autonomně, tj. bez vnějších podnětů. Pravidelný denní rytmus je tvořen na úrovni jednotlivých buněk pomocí molekulárního mechanismu periodicky zapínaných a vypínaných hodinových genů. Centrální hodiny v suprachiasmatických jádrech jsou sítí jednotlivých hodinových buněk, která přijímá informace o vnějším čase. Aby mohly hodiny úspěšně předvídat pravidelné denní změny v prostředí, musí být tímto prostředím seřizovatelné (synchronizovatelné). Zkoumáme seřizování hodin a jeho poruchy na řadě experimentálních modelů in vivo nebo in vitro.
Časový systém v našem těle se nazývá cirkadiánní systém, jelikož řídí přibližně denní (z latin. "circa dien") rytmy. Tento systém časově integruje většinu procesů v těle - od úrovně molekulární (exprese genů) a biochemické (aktivita enzymů), přes fyziologické funkce (tělesná teplota, vylučování hormonů, nebo energetický metabolismus), až po nejvyšší a nejkomplexnější úrovně (chování, spánek, příjem potravy). Naše laboratoř využívá inbrední a transgenní kmeny myší a potkanů ke studiu cirkadiánních rytmů na
Hodiny v suprachiasmatických jádrech - jako prvním se nám podařilo prokázat na molekulární úrovni mechanismus kódování informace o fotoperiodě (tj. délce světlé části dne, která se v našich zeměpisných šířkách mění během roku) v centrálních a periferních hodinách.
Hodiny v tlustém střevě - naše laboratoř jako první popsala na molekulární úrovni cirkadiánní hodiny ve výstelce tlustého střeva. Tyto hodiny jsou seřizovány potravou a průchodem tráveniny a regulují řadu místně specifických fyziologických procesů.
Aktivita hodinových genů v epitelu tlustého střeva.
Seřizování cirkadiánních hodin in vitro - jako model využíváme transgenní myš PERIOD2::Luciferase a buněčné kultury do kterých dodatečně vložíme tzv. reportér (hodinami regulovaný úsek DNA připojený ke genu pro luciferázu), který nám umožňuje přímé sledování hodin na molekulární úrovni. Hodiny in vitro lze seřizovat například pomocí vnějšího teplotního cyklu nebo pomocí různých biologicky aktivních látek.
Transgenní myš, u níž byl pomocí specifické rekombinace (tzv. knockin) vyměněn gen pro jeden z hodinových, rytmicky tvořených proteinů (Period2) za stejný gen, ovšem fúzovaný s genem pro enzym luciferázu. Luciferáza je zodpovědná za katalýzu reakce umožňující studené světélkování (luminiscenci) světlušek. V přítomnosti substrátu (luciferinu) proto buňky a tkáně této myši světélkují v pravidelném cirkadiánním rytmu. To nám umožňuje přesné a neinvazivní zkoumání hodinového mechanismu a jeho reakcí na podněty v reálném čase na molekulární a buněčné úrovni.
Význam časové regulace procesů v našem těle pro zdraví - metabolické poruchy a rakovina
Cirkadiánní systém, metabolismus a buněčný cyklus jsou navzájem propojené a ovlivnění jednoho systému způsobí změny v druhém; v případě chronického narušení časového systému může například docházet k rozvinutí závažných metabolických poruch, jako je diabetes a metabolický syndrom, i zvýšení incidence různých nádorů.
Naše laboratoř zkoumá propojení těchto systémů na různých modelech.
Cirkadiánní systém hypertenzního potkana - Naše laboratoř ukázala, že cirkadiánní systém inbredního potkan kmene SHR má odlišné vlastnosti ve srovnání se zdravým kmenem Wistar. Zkoumáme, zda tyto odlišnosti mohou souviset s rozvojem metabolických poruch.
Role cirkadiánního systému v patogenezi kolorektálního karcinomu (ve spolupráci s Oddělením Funkce epitelu). Na různých modelech (buněčné a tkáňové kultury, indukované nebo transplantované podkožní transgenní nádory u myší se sníženou imunitou) sledujeme, zda narušení cirkadiánního systému souvisí se zvýšením tvorby nádorů tlustého střeva.
Vzájemný vztah mezi endokanabinoidním a cirkadiánním systémem
Signalizace pomocí endogenních kanabinoidů (EK) je jeden ze způsobů mezibuněčné komunikace důležitý pro celou řadu nervových (senzorické vnímání, nálada, chuť k jídlu) i periferních funkcí (tvorba tuku, regulace tělesné teploty, metabolismus glukózy). Obezita je často doprovázena narušením endokanabinoidní signalizace spolu s deregulací cirkadiánního systému. V naší laboratoři zkoumáme, jak cirkadiánní hodiny ovlivňují aktivitu EK systému a zda EK mohou modulovat odpověď cirkadiánních hodin na změny metabolismu.
Ke zkoumání časové regulace EK systému a jeho role v synchronizaci cirkadiánních hodin u laboratorních potkanů Wistar využíváme monitorování pohybové aktivity, LCM-RT-qPCR, imunocytochemii, nebo hmotnostní spektrometrii. Monitorováním cirkadiánní luminiscence v reálném čase u buněčných linií a u organotypických tkáňových explantátů z transgenních myší sledujeme vliv farmakologické a genetické manipulace EK systému na cirkadiánní hodiny in vitro.
